鳩寧病毒RT-PCR試劑盒
產(chǎn)品及特點(diǎn)：
1. 一站式，用戶不需要單獨(dú)準(zhǔn)備每種成分，包括引物和對(duì)照。
2. 根據(jù)鳩寧病毒的保守基因序列設(shè)計(jì)的引物，具有良好的特異性。
3. 靈敏度可以達(dá)到 1000 拷貝/反應(yīng)。
4. 使用一管式 RT-PCR 技術(shù)，RT 和 PCR 兩步在一個(gè)試管內(nèi)完成，不需要中間轉(zhuǎn)移樣品，降低了操作誤差和可能的污染。
5. 本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的 RT-PCR。
6. 本產(chǎn)品只能用于科研，不能用于臨床。
規(guī)格及成分：
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編號(hào)
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成分
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規(guī)格
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試劑一
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5×雙酶一管式 RT-PCR Buffer
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200 μL（橘黃蓋）
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試劑二
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MMLV-Taq Mix
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75 μL（紅蓋）
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試劑三
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超純水
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1 mL（亮黃蓋）
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試劑四
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鳩寧病毒 RT-PCR 引物混合液
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100 μL（白蓋）
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試劑五
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鳩寧病毒 RT-PCR 陽(yáng)性對(duì)照（1×10E8 /μL）
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50 μL（黃蓋）
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試劑六
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使用手冊(cè)
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1 份
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注：為避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽(yáng)性對(duì)照，只提供專(zhuān)一的DNA 片段作為陽(yáng)性對(duì)照。
運(yùn)輸及保存：
低溫運(yùn)輸，-20℃保存，保存期限為 12 個(gè)月。收到貨后陽(yáng)性對(duì)照需要跟其他成分分開(kāi)放置，因?yàn)槠淙菀孜廴酒渌煞?，造成假?yáng)性。
自備試劑：
樣品 RNA。
鳩寧病毒RT-PCR試劑盒
使用方法：
一、樣品 DNA 的制備：
1. 如果有 N 個(gè)樣品，必須設(shè)置 N+2 個(gè)提取，多出的一個(gè)是 PC（樣品制備陽(yáng)性對(duì)照），一個(gè)是NC（樣品制備陰性對(duì)照）?？梢杂?10μL 鳩寧病毒 PCR陽(yáng)性對(duì)照的 1000 倍稀釋液作為制備的陽(yáng)性對(duì)照?？梢杂盟鳛橹苽涞年幮詫?duì)照。制備所得成為樣品 RNA。
2. 用自選方法純化 N+2 個(gè)樣品的 RNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)病毒 RNA 提取試劑盒兼容?？梢赃x購(gòu)本公司的柱式病毒 RNAout。
二、設(shè)置RT- PCR 反應(yīng)(20μL 體系)：
3. 如果有 N+2 個(gè)樣品，則標(biāo)記 N+4 個(gè) PCR 管(額外增加的兩個(gè)管一個(gè)是RT-PCR 陽(yáng)性對(duì)照，另一個(gè)是 RT-PCR 陰性對(duì)照)并按照下表在 PCR 管中加入下列成分：
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成份
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N+2 個(gè)
樣品管
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RT-PCR
陰性對(duì)照
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RT-PCR
陽(yáng)性對(duì)照
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5×雙酶一管式RT-PCR Buffer
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各 4 μL
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4 μL
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4 μL
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鳩寧病毒 RT-PCR 引物混合液
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各 2 μL
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2μL
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2μL
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N+2 個(gè)制備的 RNA 樣品
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各 12.5μL
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超純水
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12.5μL
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鳩寧病毒 RT-PCR 陽(yáng)性對(duì)照的 1000倍稀釋液
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--
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12.5μL
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MMLV-Taq Mix
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1.5 μL
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1.5 μL
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1.5 μL
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4.上機(jī)進(jìn)行 RT-PCR，RT-PCR 反應(yīng)參數(shù)為:
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過(guò)程
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溫度
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時(shí)間
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逆轉(zhuǎn)錄
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42℃
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30 min
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預(yù)變性
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95℃
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5 min
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PCR 反應(yīng)35個(gè)循環(huán)
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95℃
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30 sec
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58℃
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30 sec
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72℃
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20 sec
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延伸
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72℃
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7 min
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三、電泳檢測(cè)：
5. 瓊脂糖電泳檢測(cè)擴(kuò)增效果。如果陰性對(duì)照有擴(kuò)增產(chǎn)物或陽(yáng)性對(duì)照無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物，則說(shuō)明實(shí)驗(yàn)失敗，需要分析實(shí)驗(yàn)失敗的原因。只有在陰性對(duì)照沒(méi)有擴(kuò)增產(chǎn)物、陽(yáng)性對(duì)照必須有預(yù)期條帶出現(xiàn)，才有必要分析樣品的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，如果有預(yù)期片段大小的擴(kuò)增產(chǎn)物則為陽(yáng)性，如果無(wú)則為陰性。
